DNA extraction 시 사용되는 phenol의 pH : 7.9(RNA 시는 4.5)
Chloroform
Phenol이 작용시 적은 양이나마 수용액에 녹는다. 이렇게 녹은 phenol을 수용액에서 제거 및 Interphase가 잘 형성되게 해준다
Isoamyl alcohol
실험 시 거품이 생기는 거 방지 및 Interphase 형성 도움
Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol = 25 : 24 : 1 또는
Pheno
DNA의 구조에 차이로부터 분리하는 방법이 있다. 플라스미드와 염색체는 구형인데 염색체는 extract 시 구형에서 선형조각으로 깨어지며 플라스미드에는 구형으로써 변화가 없다. 이 구조적인 차이점을 이용하여 정제된 플라스미드를 얻을 수 있다.
- plasmidDNA 정제방법
1) 대규모 정제(large scale preparatio
DNA와 같이 전기영동 될 때, DNA가 움직인 정도를 알 수 있게 하는 역할을 한다.
③ 전기영동 buffer
TAE (Tris-acetate EDTA):DNA분자량이 큰 경우, agarose electrophorsis 에서 쓴다.
TBE (Tris-borate EDTA):DNA분자량이 작은 경우, DNA sequencing에 쓰인다.
4. Materials & Equipments
Restriction enzymes(BamHⅠ, NdeⅠ), pET-14b plasmid, FabG gene
Alkaline lysis method
- 세포의 cell wall과 cell membrane을 부수고 DNA만을 분리하는 방법
- Chromosomal DNA 와 plasmid의 고유한 형태 구조 차이를 이용 !
; Chromosomal DNA - 상대적으로 size가 크고, double heilx
Plasmid - size가 작고, supercoiled 형태 -> pH에 변화에 의한 변성↓
Alkaline Lysis Method
DNA gel electrophoresis(전기영동)
- DN
실험1 [Digestion of DNA with Restriction Enzyme]
실험준비물 :
Materials-restriction enzymes (ndeⅠ,BamhⅠ), restriction enzyme reaction buffer, DDW
Equipments-water bath, brief centrifuge
Procedure :
① e-tube를 두 개 준비하여, 각각 plasmid only와 inserted plasmid를 5μl 넣고, DDW 2μl,10x reaction buffer, 제한효소를 각각 1μl 넣는다. 제한효소를 가
◆실험 첫째날 2011년 10월 24일 월요일
▶원리
1 Restriction enzyme 처리
- 이 실험에서 우리는 아무 처리되지 않은 plasmid와 foreign gene을 plasmid에 삽입하여 만든 inserted plasmid에 각각 제한효소를 처리하는 실험을 했다.
- 제한효소란 DNA의 특정한 염기서열을 인식하고 인식부위 또는 그 근처의 특정 이중사
Plasmid가 Bacteria 안에 존재 하기 때문이다. 이러한 항생제 저항성은 실험실에서 종종 Selectable marker로서 이용된다. 이 같이 Plasmid에는 약제에 대한 저항성을 가진 내성인자, 세균의 자웅을 결정하는 성 결정인자 등이 발견되고 있다. 또한 Plasmid는 다른 종의 세포 내에도 전달된다.
제한효소: DNA의 특정부
1000ml을 원심 분리시킨 경우 pellet에 10ml 또는 그 이하의 배지를 붓고 resuspend시킴)
Cf. 대부분의 bacteria는 broth culture인 liquid medium에서 잘 생장한다. Liquid medium은 그 구성성분을 알 수 있는 defined medium(ex. M9)과 구성 성분을 알 수 없는 undefined medium(ex. LB)이 있는데 이번 실험에서는 LB배지를 사용하였다.
DNA가 움직인 정도를 알 수 있게 하는 역할을 한다.
c. 전기영동 buffer
TAE(Tris-acetate EDTA) : DNA 분자량이 큰 경우, agarose electrophorsis에서 쓴다.
TBE(Tris-borate EDTA) : DNA 분자량이 작은 경우, DNA sequencing에 쓰인다.
Procedure
Material & Equipment
Restriction enzymes(BamHI, NdeI), pET-14b, FabG gene이 inserted pET-14b plasmid, DDW , 10 x r
DNA를 절단, 제거하기 위한 방어기전으로 사용된다. 이 때, 자신의 DNA가 제한효소에 인식되어 잘리는 것을 막기 위해 자기 DNA 절단부위의 염기를 methylation 시켜서 보호하고 있다. 이러한 제한효소는 총 3종류로 나눌 수가 있지만 실험실에서는 대부분이 type Ⅱ 가 사용된다.
3. Type II restriction enzyme: 거의